血管生长素基因突变与中国汉族家族性肌萎缩
血管生长素基因突变与中国汉族家族性肌萎缩侧索硬化的关系
作者：张华纲张英爽唐璐张楠樊东升
文章来源：中华内科杂志,,54(02)
摘要1目的
通过对31个中国汉族家族性肌萎缩侧索硬化(FALS)家系先证者进行血管生长素(ANG)基因突变检测，探讨中国汉族FALS与ANG基因突变的关系。
2方法
采集年至医院神经内科确诊的31个肌萎缩侧索硬化(ALS)家系的临床资料。利用PCR技术和直接测序的方法，检测各家系先证者的ANG基因是否存在变异。
3结果
31个ALS家系均呈常染色体显性遗传。全部31例先证者未发现存在ANG基因单核苷酸多态性(SNP)和突变。
4结论
ANG基因的SNP及突变在中国汉族FALS患者中可能非常少见。
肌萎缩侧索硬化(ALS)是一种以选择性损伤上下运动神经元为特点的致死性神经系统变性疾病。其中家族性ALS(FALS)约占5%～10%，通常表现为常染色体显性遗传，在临床表现上与散发性ALS(SALS)无明显区别。目前，FALS按照遗传标记的不同分型，其亚型已经超过14种。最常见的亚型是ALS1，其致病基因为铜、锌超氧化物歧化酶(SOD1)基因[1,2]。ALS9亚型以血管生长素(ANG)基因为遗传标记，该亚型患者成人起病，呈常染色体显性遗传，临床表现与典型的ALS相同[3,4]。ANG基因位于染色体14q11，全长5.4kb，含有2个外显子，仅第2外显子编码氨基酸。目前发现的与ALS相关的ANG基因变异包括：1种单核苷酸多态性(SNP)，即SNPrs(TG，G86G)，以及约29种基因突变。ANG与ALS关系的相关研究主要集中于欧美白种人群，而且主要是在SALS患者中进行筛检[3,4,5,6]。亚洲人群的报道较少，涉及FALS的病例数均不超过10例[7,8]。本研究通过对31个中国ALS家系的先证者进行基因突变分析，检测其是否存在ANG基因的变异。对象与方法1研究对象收集至医院神经内科ALS专病门诊确诊的31个ALS家系的先证者，均经过神经科、神经影像、神经电生理及血液学检查，诊断符合年世界神经病学联盟ElEscorial诊断标准(修订版)。本研医院伦理委员会批准()，全部患者在纳入研究前由研究者给予充分的知情说明，并签署知情同意书。
选取与先证者性别和年龄相匹配的50名健康中国汉族受试者作为对照，医院健康体检的受检者，排除了高血压病、冠心病、脑血管病、糖尿病及相应家族史。均签署了知情同意书。
2研究方法对所有研究对象均采集详细的临床资料。抽取先证者外周静脉血，提取基因组DNA。31个先证者均经基因测序排除了SOD1基因突变，实验条件参见既往报道[9]。利用PCR技术扩增ANG基因第2外显子，对PCR产物进行纯化后直接测序。PCR引物设计：上游，5′CGGTTGGAGCTAGAGGTTGT3′；下游，5′AATGGAAGGCAAGGACAGC3′。扩增条件：预变性94℃5min；94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃再延伸10min。PCR产物片段长度为bp，包含整个编码区和5′侧翼区[10]。为排除可能检测到的变异为多态性，另对与先证者组性别和年龄相匹配的50名正常中国汉族受试者按照上述方法进行ANG基因第2外显子测序。
3统计学处理采用描述性方法进行数据分析。
结果1临床特点本研究31个FALS家系来自中国大陆15个省、自治区和直辖市，均呈常染色体显性遗传。先证者均为汉族，其中男18例，女13例(男女比例为1∶0.7)，起病年龄21～69(50.1±13.3)岁。上肢起病者17例(54.8%)，下肢起病者12例(38.7%)，球部起病者2例(6.5%)。随访至年5月，已有6例先证者(男女各3例)死亡，死因均为呼吸衰竭或肺部感染，生存期为15～个月。
2突变分析全部31例FALS先证者均未发现ANG基因第2外显子编码区和5′侧翼区存在SNP和突变。50名正常对照者中发现1例存在SNPrs(TG，G86G)(图1)。
图1
50名正常对照者中测序检出1例血管生长素基因单核苷酸多态性[rs(TG，G86G)]
讨论目前，ALS患者中ANG基因多态性和突变的研究报道主要集中在欧美人群，亚洲人群的相关报道较少。Kwon等[7]筛查了9例FALS和例SALS韩国患者，未发现ANG基因变异。年Zou等[8]检测了10例FALS和例SALS中国汉族患者，在ALS患者和正常对照中均发现了SNPrs，并在1例(0.5%)SALS患者中发现了VI突变。我们在31例中国汉族FALS先证者中未发现ANG基因的SNP和突变，即这31个ALS家系中无ALS9亚型患者。50例正常对照中发现1例(2.0%)存在SNPrs。
ALS9是一种罕见的ALS亚型，临床表现同典型的ALS，呈常染色体显性遗传，外显率低[3,4]。年Greenway等[3]发现ANG基因的SNPrs与爱尔兰和苏格兰地区的SALS相关。但这一结果未能在包括英格兰、瑞典、意大利和美国等其他地区的人群中得以重复[11,12]。年Greenway等[4]在例ALS患者中发现了7种ANG的错义突变，突变出现在4例FALS和11例SALS患者中。
目前报道了约29种ANG突变，主要是错义突变。ANG基因突变检出率在FALS为0～2.6%，在SALS为0～1%[4,5,6]。年vanEs等[13]报道了一个荷兰的肌萎缩侧索硬化-额颞叶痴呆(ALS-FTD)家系具有K17I突变。故ALS9包含典型的常染色体显性遗传的FALS、SALS和ALS-FTD。
ANG首先是在肿瘤细胞中被发现，随后的研究证实ANG广泛存在于人体细胞中[14]，并在运动神经元中高表达[15]。ANG具有强大的促血管新生作用、较弱的核糖核酸酶活性，并在神经细胞的生长与分化中发挥重要作用[16]。ANG属于核糖核酸酶(RNase)超家族，主要在肝脏产生。
ANG主要有3个结构域：细胞表面受体结合位点、核锚定序列和RNase活性中心[17]。细胞表面受体结合位点可使ANG定位于细胞膜上，进入细胞。核锚定序列可使ANG进入细胞核，并聚集在核仁附近。RNase活性中心发挥激活tRNA转录、蛋白质翻译和细胞增殖的功能，促进血管新生[18]。
ANG全长由个氨基酸残基组成，其中24个残基组成了信号肽，其功能是帮助蛋白质正确分泌。当信号肽分离出去后，剩余的个残基组成了成熟的ANG。H13、K40和H组成了催化部位，第31～35氨基酸残基构成了入核转运信号[17,18]。目前发现的突变集中于这两个结构域中。运动神经元对缺氧非常敏感，正常的ANG可以保护运动神经元免受缺氧损害，而突变的ANG丧失了保护功能。
体外研究显示，ANG突变体损害了运动神经元突起的生长和延伸[19]。而应用人类重组ANG可延长G93A-SOD1转基因小鼠的生存期[15]。推测ALS9亚型可能的发病机制是：基因突变破坏了ANG的分泌、核转运及其RNase的活性，使血管生成障碍，并产生毒性，导致了ALS[20]。
年Millecamps等[6]报道了在例FALS患者中有2例(1.2%)同时具有肉瘤融合基因(FUS)和ANG的突变，分别为RC-FUS和K17I-ANG，及RS-FUS和K54E-ANG，而患者的临床表现同典型的ALS。作者认为FUS突变在FALS的发病过程中起主导作用，而ANG与ALS的关系并不明确。
Luigetti等[21]报道了1例具有G93D-SOD1突变的女性SALS患者，发病30个月后死亡，较通常的G93D-SOD1的病程明显缩短，进一步检测发现该患者合并1个ANG突变(RC)。研究者认为ANG可能不是ALS主要的致病基因，而是作为一个调节基因参与了发病，影响了临床过程。上述研究提示ANG可能是ALS发病的次要基因，同时也支持了ALS为寡基因病，而非单基因病的假说。
本研究显示，在31例中国汉族FALS先证者中未发现ANG基因的SNP和突变。该结果表明，在中国汉族FALS患者中，ANG基因的变异可能是非常少见的。可能的原因一是地域和遗传背景的差异，二是病例数较少。张英爽等[10]在例中国汉族健康受试者中检测到7例(2.6%)杂合型SNPrs，显示中国汉族人群G等位基因的频率显著低于欧洲白种人[11]。本研究中正常对照的SNPrs的检出率为2.0%，与张英爽等[10]的结果近似
。进一步增加FALS的病例数并对SALS进行基因检测，将有助于较为完整地评判中国人群ALS与ANG基因的关系。另外，不排除少数患者同时具有两种已知基因的突变，故对已经检测出常见的致病基因如SOD1、TAR-DNA结合蛋白43(TDP-43)和FUS等突变的病例，检测ANG基因，可能会帮助我们更好地理解不同基因对于ALS发生发展的作用。
中华内科杂志